รายละเอียด

เมื่อเดือนธันวาคม ปี พ.ศ. 2562 โรคโคโรนาไวรัส (COVID-19) ได้ถูกแพร่กระจายและติดต่อจากคนสู่คนไปทั่วโลก โรคนี้เป็นโรคติดเชื้อซึ่งเกิดมาจากไวรัส SAR-CoV-2. ณ ปัจจุบันนี้ วิธีมาตรฐานที่ใช้ในการตรวจโรค COVID-19 นั่นก็คือ RT-PCR อย่างไรก็ตาม วิธีการตรวจแบบ RT-PCR นั้นมีราคาที่สูงและต้องใช้เวลานาน ส่วนทางเลือกอื่น เช่น วิธีการตรวจแบบ ATK สามารถลดระยะเวลาในการตรวจได้อีกทั้งยังง่ายต่อการใช้งาน แต่ทว่า ความไว (sensitivity) ของวิธีการตรวจนี้มีเพียงแค่ 49%. ระบบ CRISPR-Cas12a ถูกพัฒนาเพื่อเป็นวิธีการตรวจแบบใหม่ซึ่งสามารถให้ค่า ความไว (sensitivity) และ ความจำเพาะ (specificity) ที่สูงเทียบเท่ากับวิธีการแบบ RT-PCR อีกทั้งยังคงความง่ายต่อการใช้งานและเวลาการตรวจที่รวดเร็วแบบ ATK. โครงการวิจัยฉบับนี้ได้มีความมุ่งหมายที่จะประยุกต์ระบบ CRISPR-Cas12a เข้ากับอุปกรณ์ Paper-based microfluidics โดยรวมขั้นตอนการวิเคราะห์ผลของระบบ CRISPR-Cas12a ให้อยู่ภายในอุปกรณ์เพียงชิ้นเดียว เพื่อใช้ในการสร้างอุปกรณ์ชนิดใหม่ที่สามารถเพิ่มการเข้าถึงการใช้งานได้มากยิ่งขึ้น โดยมีความแม่นยำที่สูง, ใช้เวลาทดสอบที่รวดเร็ว, เป็นอุปกรณ์ทดสอบเพื่อวินิจฉัยโรคที่มีราคาถูก (POC), เป็นมิตรต่อร่างกาย และเป็นอุปกรณ์ที่ง่ายต่อการสร้าง. โครงงานวิจัยนี้ได้ริเริ่มด้วยการสันนิษฐานว่าเป้าหมายในลำดับพันธุกรรมของดีเอ็นเอต้นแบบมีมากเพียงพอในสารตัวอย่าง ซึ่งนำไปสู่การลดทอนขั้นตอนการเพิ่มจำนวน (Amplification step) ที่ใช้เวลา 30 นาที และสนใจเพียงแค่ขั้นตอนการตรวจ Cas12a ที่ใช้เวลา 15 นาทีเท่านั้น.
การออกแบบอุปกรณ์ถูกสร้างขึ้นผ่านโปรแกรม AutoCAD 2023 และสร้างขอบเขตช่องทางการไหล (Hydrophobic barrier) บนกระดาษกรอง Double Ring 102 โดยใช้เครื่องพิมพ์แบบถ่ายเทความร้อน (Thermal Transfer Printer). อุปกรณ์ถูกอบเพื่อละลายหมึกคาร์บอนโดยใช้เตาอบไฟฟ้าเป็นเวลา 15 นาที ที่อุณหภูมิ 120 องศาเซลเซียส ซึ่งเป็นอุณหภูมิและเวลาที่เหมาะสมสำหรับการละลายหมึกคาร์บอน. สำหรับขั้นตอนการวิเคราะห์ประสิทธิภาพของการผสมตัวอย่างในช่องไมโครแชแนล, การออกแบบที่แตกต่างกันสามรูปแบบของตัวต้นแบบ ได้แก่ รูปแบบกากบาท, รูปแบบตัว T, และรูปแบบตัว Y ได้ถูกนำมาใช้เป็นฐานในการผสมกันของสีเหลืองและสีฟ้า ที่ใช้แทนการผสมกันของตัวอย่างและน้ำยา CRISPR ซึ่งจะได้ผลลัพธ์เป็นสีเขียว. การวิเคราะห์สีที่ใช้นั้นได้แก่ค่า Hue จาก โมเดลสี HSV เพื่อวิเคราะห์การผสมกันของตัวอย่างในไมโครแชแนล. ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า รูปแบบกากบาท เป็นรูปแบบที่มีประสิทธิภาพสำหรับการผสมสีมากที่สุด โดยพบว่า 80% ผสมกันในระยะทางที่สั้นกว่ารูปแบบอื่นๆ. ลักษณะเฉพาะของอุปกรณ์ที่เหมาะสมที่สุดคือ 4 mm สำหรับความกว้างของช่อง และ 2.55 mm สำหรับความยาวของช่อง อีกทั้งปริมาณของสารตัวอย่างและน้ำยา CRISPR ที่เหมาะสมคือ 40 uL.
โดยสรุป เราได้สำเร็จในการสร้างอุปกรณ์ Paper-based microfluidics ที่มีรูปแบบที่เหมาะสมสำหรับการควบคุมการไหลและการผสมของระบบ CRISPR-Cas12a

วัตถุประสงค์

เมื่อเดือนธันวาคม ปี พ.ศ. 2652 โรคโคโรนาไวรัส (COVID-19) ได้ถูกรายงานเป็นครั้งแรกในมณฑลอู่ฮั่น ประเทศจีน โรคชนิดนี้เป็นโรคแบบติดเชื้อเกิดจากไวรัส SAR-CoV-2 โดยกระจายและติดเชื้อจากคนสู่คนไปทั่วทั้งโลก. อาการที่พบได้ปกติทั่วไปในผู้ป่วย COVID-19 คือมีไข้สูง ไอ เจ็บคอ ปวดหัว และหายใจลำบาก ซึ่งเป็นอาการที่คล้ายคลึงกับโรคไข้หวัดใหญ่ อย่างไรก็ตาม ในกรณีที่อาการรุนแรงสามารถพบอาการหายใจลำบากเฉียบพลัน (acute respiratory distress syndrome, ARDS) ซึ่งนำไปสู่การป่วยแบบรุนแรงได้เสียชีวิตได้. ในระยะเวลาสามปีที่ผ่านมา คนไทย 4.4 ล้านคน ได้ติดเชื้อ COVID-19 และอัตราการเสียชีวิตยังคงเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องถึงประมาณ 30,000 คน. ณ ปัจจุบันนี้ วิธีการวินิจฉัยโรค COVID-19 ที่เป็นวิธีการมาตรฐานนั้นคือ Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Real-Time RT-PCR). อย่างไรก็ตาม วิธีการตรวจแบบ RT-PCR นั้นมีราคาสูง ต้องการผู้เชี่ยวชาญในการตรวจสอบ ซึ่งไม่เหมาะที่จะใช้ตรวจคนจำนวนมาก อีกทั้งยังใช้เวลาในการทดสอบนานมากถึง 24 ชั่วโมง ดังนั้นจึงมีข้อเสนอให้ใช้การตรวจแบบรวดเร็วโดยการใช้ Antigen Test Kit (ATK) มาแทนที่ ข้อดีของ ATK นั้นคือการที่ใช้เวลาตรวจสอบและได้ผลลัพธ์ภายในเวลา 15-30 นาที แต่ทว่า ข้อเสียหลักของ ATK นั้นคือการมีผลลัพธ์ลวง (False negative) ที่สูง ซึ่งสูงถึง 11.5% และทำให้วิธีการตรวจนี้ไม่สามารถใช้เป็นวิธีการตรวจโรค COVID-19 ที่มาตรฐานได้ ดังนั้น เพื่อพัฒนาวิธีการวินิจฉัยโรคแบบใหม่ ทั้งวิธีการตรวจโรคแบบ RT-PCR และ ATK ถูกเลือกเพื่อรวมข้อดีของทั้งสองวิธีการไว้ด้วยกันโดยการใช้อุปกรณ์ Paper-based microfluidic เป็นแพลตฟอร์มเพื่อนำไปใช้กับการทดสอบแบบ CRISPR-Cas12 สำหรับการตรวจโรค COVID-19

การทดสอบแบบ CRISPR เป็นวิธีการที่สามารถนำมาใช้เพื่อตรวจสอบไวรัส SAR-CoV-2 ซึ่งได้รับการอนุมัติจาก US Food and Drug Administration (FDA). วิธีการ CRISPR-Cas และ recombinase polymerase amplification ถูกนำมารวมเข้าด้วยกันเพื่อการเพิ่มจำนวนและการตรวจจับดีเอ็นเอที่เป้าหมายของลำดับพันธุกรรม ลำดับพันธุกรรมเป้าที่จำเพาะเจาะจงของดีเอ็นเอจะถูกตัดโดยโปรตีนตัวพา Cas ซึ่งมีความสอดคล้องกับดีเอ็นเอเป้าหมายในลำดับพันธุกรรมของ CRISPR RNA (crRNA) หลังจากดีเอ็นเอเป้าหมายของลำดับพันธุกรรมได้ถูกจับแล้ว โปรตีน Cas12a จะถูกกระตุ้นเพื่อตัด fluorescent reporter จาก quencher และส่งสัญญาณฟลูออเรสเซนส์เพื่อให้เรืองแสงสว่าง ดังนั้น วิธีการนี้จึงสามารถตรวจสอบผลลัพธ์ได้ทั้งแบบผลลัพธ์เชิงคุณภาพ (Qualitative) และผลลัพธ์เชิงปริมาณ (Quantitative) 

เพื่อที่จะนำการทดสอบแบบ CRISPR มาใช้ อุปกรณ์ Paper-based microfluidic จึงถูกเลือกมาใช้เป็นอุปกรณ์สำหรับการทำการทดสอบ เนื่องจากอุปกรณ์ชนิดนี้สามารถรวมการทดสอบแบบ CRISPR ที่มีหลายขั้นตอนไว้ในอุปกรณ์เดียวได้ จึงทำให้การใช้งานนั้นเป็นไปอย่างง่ายดาย ราคาถูก ไม่เป็นอันตรายต่อมนุษย์ และสามารถสร้างขึ้นมาได้ง่าย

ผู้จัดทำ

อัจฉรา เทพบุตร

AUJCHARA THEPBUT

#นักศึกษา

สมาชิก

พิมพ์ขวัญ หาญนันทอนันต์

Pimkhuan Hannanta-anan

#อาจารย์

อาจารย์ที่ปรึกษา

โหวตนวัตกรรมนี้