Details

Since December 2019, a Coronavirus Disease (COVID-19) has spread and infected from person-to-person across the world. It is an infectious disease, caused by the SAR-CoV-2 virus. Currently, the gold standard for COVID-19 detection is RT-PCR. However, RT-PCR is expensive and time-consuming. An alternative such as the ATK method can reduce the detection time and increase ease of use, but the sensitivity
of this method is only 49%. The CRISPR-Cas12a system is developed to be a novel detection method, which provides a high sensitivity and specificity rivaling RT-PCR while sharing the ease of use and rapidity of test of the ATK method. This project aims to apply the CRISPR-Cas12a system into the paper-based microfluidic devices by integrating the multiple steps of assay within one device for creating a novel diagnostic platform owing to increase the accessibility, high accuracy, provides a rapid testing, low-cost point-of-care (POC) medical diagnostics, high biocompatibility, and easy to fabricate. This project commenced with the assumption of sufficient target sequences of DNA template in the sample, eliminating the requirements of amplification step (30 minutes) and only focused on the Cas12a detection step (15 minutes).

The device’s designs were created via AutoCAD 2023 program and easily fabricated hydrophobic barriers on Double Ring 102 filter paper by Thermal Transfer Printer. The devices were heated to melt the carbon ribbon by using an electric oven for 15 minutes at 120 °C, which is the optimal heating temperature and heating time. In order to analyze the effective of sample mixing in microchannel, three different designs
of prototype i.e., cross-shape, T-shape, and Y-shape, were utilized with yellow and blue dye solutions representing as samples and CRISPR reagents, forming green color. This colorimetric analysis used the Hue from HSV color model to analyze the sample mixing in microchannel. The results indicated that the cross-shape is the most effective design for liquid mixing as we observed 80% sample mixing at a shorter distance than other designs. The optimal characteristic of devices is 4 mm in channel width and 2.55 mm in channel length. Additionally, the optimal sample and CRISPR reagent volume is 40 𝜇L. 

In conclusion, we successfully created paper-based microfluidic devices with an
optimal design for regulating the flows and the mixing of the CRISPR-Cas12a system.

Objective

เมื่อเดือนธันวาคม ปี พ.ศ. 2652 โรคโคโรนาไวรัส (COVID-19) ได้ถูกรายงานเป็นครั้งแรกในมณฑลอู่ฮั่น ประเทศจีน โรคชนิดนี้เป็นโรคแบบติดเชื้อเกิดจากไวรัส SAR-CoV-2 โดยกระจายและติดเชื้อจากคนสู่คนไปทั่วทั้งโลก. อาการที่พบได้ปกติทั่วไปในผู้ป่วย COVID-19 คือมีไข้สูง ไอ เจ็บคอ ปวดหัว และหายใจลำบาก ซึ่งเป็นอาการที่คล้ายคลึงกับโรคไข้หวัดใหญ่ อย่างไรก็ตาม ในกรณีที่อาการรุนแรงสามารถพบอาการหายใจลำบากเฉียบพลัน (acute respiratory distress syndrome, ARDS) ซึ่งนำไปสู่การป่วยแบบรุนแรงได้เสียชีวิตได้. ในระยะเวลาสามปีที่ผ่านมา คนไทย 4.4 ล้านคน ได้ติดเชื้อ COVID-19 และอัตราการเสียชีวิตยังคงเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องถึงประมาณ 30,000 คน. ณ ปัจจุบันนี้ วิธีการวินิจฉัยโรค COVID-19 ที่เป็นวิธีการมาตรฐานนั้นคือ Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Real-Time RT-PCR). อย่างไรก็ตาม วิธีการตรวจแบบ RT-PCR นั้นมีราคาสูง ต้องการผู้เชี่ยวชาญในการตรวจสอบ ซึ่งไม่เหมาะที่จะใช้ตรวจคนจำนวนมาก อีกทั้งยังใช้เวลาในการทดสอบนานมากถึง 24 ชั่วโมง ดังนั้นจึงมีข้อเสนอให้ใช้การตรวจแบบรวดเร็วโดยการใช้ Antigen Test Kit (ATK) มาแทนที่ ข้อดีของ ATK นั้นคือการที่ใช้เวลาตรวจสอบและได้ผลลัพธ์ภายในเวลา 15-30 นาที แต่ทว่า ข้อเสียหลักของ ATK นั้นคือการมีผลลัพธ์ลวง (False negative) ที่สูง ซึ่งสูงถึง 11.5% และทำให้วิธีการตรวจนี้ไม่สามารถใช้เป็นวิธีการตรวจโรค COVID-19 ที่มาตรฐานได้ ดังนั้น เพื่อพัฒนาวิธีการวินิจฉัยโรคแบบใหม่ ทั้งวิธีการตรวจโรคแบบ RT-PCR และ ATK ถูกเลือกเพื่อรวมข้อดีของทั้งสองวิธีการไว้ด้วยกันโดยการใช้อุปกรณ์ Paper-based microfluidic เป็นแพลตฟอร์มเพื่อนำไปใช้กับการทดสอบแบบ CRISPR-Cas12 สำหรับการตรวจโรค COVID-19

การทดสอบแบบ CRISPR เป็นวิธีการที่สามารถนำมาใช้เพื่อตรวจสอบไวรัส SAR-CoV-2 ซึ่งได้รับการอนุมัติจาก US Food and Drug Administration (FDA). วิธีการ CRISPR-Cas และ recombinase polymerase amplification ถูกนำมารวมเข้าด้วยกันเพื่อการเพิ่มจำนวนและการตรวจจับดีเอ็นเอที่เป้าหมายของลำดับพันธุกรรม ลำดับพันธุกรรมเป้าที่จำเพาะเจาะจงของดีเอ็นเอจะถูกตัดโดยโปรตีนตัวพา Cas ซึ่งมีความสอดคล้องกับดีเอ็นเอเป้าหมายในลำดับพันธุกรรมของ CRISPR RNA (crRNA) หลังจากดีเอ็นเอเป้าหมายของลำดับพันธุกรรมได้ถูกจับแล้ว โปรตีน Cas12a จะถูกกระตุ้นเพื่อตัด fluorescent reporter จาก quencher และส่งสัญญาณฟลูออเรสเซนส์เพื่อให้เรืองแสงสว่าง ดังนั้น วิธีการนี้จึงสามารถตรวจสอบผลลัพธ์ได้ทั้งแบบผลลัพธ์เชิงคุณภาพ (Qualitative) และผลลัพธ์เชิงปริมาณ (Quantitative) 

เพื่อที่จะนำการทดสอบแบบ CRISPR มาใช้ อุปกรณ์ Paper-based microfluidic จึงถูกเลือกมาใช้เป็นอุปกรณ์สำหรับการทำการทดสอบ เนื่องจากอุปกรณ์ชนิดนี้สามารถรวมการทดสอบแบบ CRISPR ที่มีหลายขั้นตอนไว้ในอุปกรณ์เดียวได้ จึงทำให้การใช้งานนั้นเป็นไปอย่างง่ายดาย ราคาถูก ไม่เป็นอันตรายต่อมนุษย์ และสามารถสร้างขึ้นมาได้ง่าย

Project Members

อัจฉรา เทพบุตร

AUJCHARA THEPBUT

#นักศึกษา

Member

พิมพ์ขวัญ หาญนันทอนันต์

Pimkhuan Hannanta-anan

#อาจารย์

Advisor

Vote for this Innovation!