Details

-

Objective

ความเป็นมาและความสำคัญของปัญหา
	เครื่องหมายดีเอ็นเอ (DNA molecular weight markers) หรือที่เรียกกันในชื่อ บันไดดีเอ็นเอ (DNA Ladder) เป็นหนึ่งในรีเอเจนต์ที่แพร่หลายมากที่สุดในชีววิทยาระดับโมเลกุลที่ใช้ในห้องปฏิบัติการระดับโมเลกุลช่วยให้สามารถประมาณขนาดชิ้นส่วนของกรดนิวคลีอิกหรือความยาวคู่เบส (bp) ของกรดนิวคลีอิก ที่สำคัญสามารถใช้ในการทดลองได้อย่างหลากหลาย รวมถึงจำกัดการย่อยด้วยเอนไซม์, การขยายปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR), Northern and Southern blotting, และการใช้งานทุกประเภทที่ใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส เนื่องจากสเปกตรัมของขนาดชิ้นส่วนในการทดลองเหล่านี้ครอบคลุมตั้งแต่หมื่นคู่เบส จึงมักใช้ช่วงขนาดมาตรฐานน้ำหนักโมเลกุลตั้งแต่สองขนาดขึ้นไป ladder 100 bp โดยทั่วไปให้ส่วนเพิ่มจาก 100 bp ถึง 1,000 bp และ ladder 1 kb ครอบคลุมคู่เบสตั้งแต่ 500 ถึงหลายพันคู่โดยสามารถหาซื้อได้จากแหล่งเชิงพาณิชย์และการสร้างขึ้นในห้องปฏิบัติการ เช่น ยี่ห้อ Thermo scientific ขนาด 100 bp ราคาซื้อขายประมาณ 488 ดอลลาร์สหรัฐ ขนาด 1 Kb ราคาซื้อขายประมาณ 212 ดอลลาร์สหรัฐ และยี่ห้อ New England Biolabs ขนาด 100 bp ราคาซื้อขายประมาณ 466 ดอลลาร์สหรัฐ ขนาด 1 Kb ราคาซื้อขายประมาณ 282 ดอลลาร์สหรัฐ  และการสร้างขึ้นในห้องปฏิบัติการตัวอย่างเช่น การย่อยของ EcoRI-HindIII ของแลมบ์ดาฟาจ DNA และการย่อย MspI ของพลาสมิด pBR322 (ดังแสดงในรูปที่ 1.1) แต่ก็พบว่าการค้นหาแหล่ง DNA ฟาจแลมบ์ดาที่มีราคาไม่แพงสำหรับการสร้างเครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุล EcoRI-HindIII เป็นเรื่องที่ค่อนข้างยากและราคา DNA Ladder ที่หาซื้อจากแหล่งเชิงพาณิชย์มีราคาแพงเช่นเดียวกันเนื่องจากการเข้าถึงแหล่งเงินทุนในบางประเทศทั่วโลกมีการจำกัดมากขึ้นโดยเฉพาะในประเทศที่กำลังพัฒนา
การสกัด Plasmid เป็นวิธีการมาตรฐานที่ใช้ในการแยก วิเคราะห์ และทำให้ดีเอ็นเอบริสุทธิ์จึงเป็น เทคนิคที่สำคัญมากในการศึกษาและวิจัยด้านพันธุวิศวกรรม อีกทั้งยังเป็นเทคนิคที่ทำได้ ง่าย รวดเร็ว และประหยัด ใช้แยกดีเอ็นเอขนาด 0.2-50 กิโลเบสโดยมีวิธีที่น่าสนใจ Alkaline lysis คือการนำแบคทีเรียที่มีพลาสมิดที่สนใจนำมาถูกเพาะเลี้ยงในขั้นแรก จากนั้นจึงนำไปปั่นแยกตัวอย่างเพื่อให้เซลล์มีความเข้มข้น (รวมถึงDNA ) ตกลงสู่ด้านล่างของภาชนะ ส่วนใสตะกอนจะถูกทิ้งไป จากนั้น pellet จะถูกแขวนลอยอีกครั้งในบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย EDTA วัตถุประสงค์ของ EDTA คือเพื่อคีเลตไอออนบวกของโลหะไดวาเลนต์ เช่น Mg2+ และ Ca 2+ซึ่งจำเป็นสำหรับการทำงานของเอนไซม์ย่อยสลาย DNA ( DNAses ) และยังทำหน้าที่ลดความเสถียรของแกนหลัก DNA ฟอสเฟตและผนังเซลล์อีกด้วย กลูโคสในบัฟเฟอร์จะรักษาแรงดันออสโมติกของเซลล์เพื่อป้องกันไม่ให้เซลล์แตก ทริสในบัฟเฟอร์จะรักษาค่า pH ของเซลล์ไว้ที่ 8.0 และ RNase จะกำจัด RNA ซึ่งจะขัดขวางการทดลองทำการแยกสารละลายอัลคาไลน์เข้มข้น ซึ่งประกอบด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) และเบสแก่ เช่นโซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) เตรียมไว้แล้วเติมเข้าไป ส่วนผสมที่ได้จะถูกพักเป็นเวลา2-3 นาที ในช่วงเวลานี้ สารชะล้างจะไปรบกวนเยื่อหุ้มเซลล์ และปล่อยให้อัลคาไลสัมผัสและทำลายธรรมชาติทั้งโครโมโซมและพลาสมิด DNA หลังจากแยกเยื่อหุ้มเซลล์ออกด้วย SDS ปริมาณของเซลล์จะทำให้ NaOH เป็นกลาง นี่คือสาเหตุที่ pH ของการสลายลดลงจาก 12.8 เป็น 12.3 ดังนั้นหากมีเซลล์แบคทีเรียไม่เพียงพอ NaOH ส่วนเกินจะทำงานเพื่อสร้างชิ้นส่วน DNA ขนาดเล็ก แต่สามารถใช้ L-อาร์จินีน 0.5 โมลาร์ ซึ่งสามารถให้ค่า pH ที่เสถียรได้ สามารถใช้แทนโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.1 โมลาร์ได้ หลังจากก็เติมโพแทสเซียมอะซิเตตจะทำให้สารละลายเป็นกรดและทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของพลาสมิด DNA แต่ไม่ใช่โครโมโซม DNA ซึ่งตกตะกอนออกจากสารละลาย หน้าที่อีกประการหนึ่งของโพแทสเซียมคือการทำให้เกิดการตกตะกอนของโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตและกำจัดสารชะล้างออกไป การปั่นเหวี่ยงครั้งสุดท้ายจะดำเนินการ และคราวนี้ pelletจะมีเพียงเศษซากเท่านั้นและสามารถทิ้งได้ ส่วนลอยเหนือตะกอนที่มี พลาสมิดจะถูกกำจัดออกอย่างระมัดระวัง และสามารถทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมหรือใช้สำหรับการวิเคราะห์ เช่น เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส

Project Members

ทัตพิชา จันทร์งาม

THATPHICHA CHANNGAM

#นักศึกษา

Member

สุดารัตน์ ศรีสังข์

SUDARAT SRISUNG

#นักศึกษา

Member

ธิปชัย วัฒนวิจารณ์

Tipachai Vatanavicharn

#อาจารย์

Advisor

Vote for this Innovation!